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PCR扩增问题
发布日期:2016-10-24      阅读(457 )    返回列表

PCR扩增带异常的原因及分析


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  使用PCR时,最常碰到的问题就是会出现扩增带有异。借此机会,我们与大家探讨一下PCR扩增条带有异时的原因及解决方案。

假阴性,不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有:

① 摸板核酸的制备

② 酶的质量

③ 引物的质量与特异性

④ PCR循环条件

原因分析:

① 模板:模板中含有杂蛋白质、含有Taq酶抑制剂或模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的 组蛋白。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

② 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

③ 引物:引物的质量、浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有

些引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增。解决办法为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,需要和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。

④ Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

⑤ 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul 或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,做完小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

⑥ 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

⑦ 靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。


假阳性

PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

原因分析:

①引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

②靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。

③外界环境:空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。



出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因分析:

①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。

③酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

解决办法:

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。


出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

原因分析:

由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

解决办法:

①减少酶量,或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度,增加模板量,减少循环次数。